Wiele gatunków owadów, mięczaków strefy pływowej, płazów i gadów oraz niektóre ssaki strefy arktycznej mają dużą tolerancję niskiej temperatury. Wynika ona z obniżania temperatury krystalizacji oraz eliminowania ośrodków krystalizacji, które umożliwiają zmiany stężenia substancji zapobiegających powstawianiu lodu i zawartości wody w tkankach.

Bezkręgowce i liczne zmiennocieplne kręgowce wykorzystują dwie strategie umożliwiające przeżycie w temperaturze poniżej 0°C. Pierwsza z nich to tolerancja zamarzania, czyli zdolność przeżycia, mimo częściowego zamarznięcia płynów ustrojowych. Wiąże się ona głównie z syntezą różnych enzymów i innych białek w wątrobie. U niektórych organizmów, np. u ślimaków, tolerancja zamarzania jest związana także ze zmianą masy ciała, wynikającą z opróżnienia jelit. W ten sposób eliminuje się też ośrodki krystalizacji, którymi mogą być mikroorganizmy żyjące w przewodzie pokarmowym. Tolerancja zamarzania jest charakterystyczna dla płazów, które żyjąc w środowisku wilgotnym i nie kopiąc na zimę kryjówek, są narażane na ujemną temperaturę, a w konsekwencji powstawanie w organizmie kryształów lodu.

Druga strategia to oporność na zamarzanie, polegająca na utrzymywaniu płynów ustrojowych w stanie przechłodzenia, czyli obniżeniu temperatury ich zamarzania¹. Tę obniżoną temperaturę, często przekraczającą –10°C, nazywamy temperaturą krystalizacji (Tc) lub temperaturą punktu przechłodzenia. Stan przechłodzenia jest charakterystyczny dla gadów – zimują one w mniej wilgotnych miejscach niż płazy, dlatego są mniej narażane na powstawanie w organizmie kryształów lodu. Przechłodzenie występuje także u ryb polarnych mających we krwi glikoproteiny, zapobiegające wzrostowi kryształów lodu lub osłabiające strukturę lodu w stopniu powodującym topnienie².

Zarówno tolerancja zamarzania, jak i oporność na zamarzanie wiążą się z akumulacją związków, które mają właściwości krioprotekcyjne, oraz obecnością we krwi specyficznych białek INP (ice nucleating proteins) i THP (thermal hysteresis proteins)³, umożliwiających kontrolę procesu zamarzania.

Istnieją dwa typy substancji krioprotekcyjnych. Pierwszy, to substancje kumulowane w wysokim stężeniu, których działanie podnosi osmolarność płynów ustrojowych, utrzymując względnie stały poziom wody, zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki. Substancje krioprotekcyjne drugiego typu są gromadzone w małych stężeniach, a ich rolą jest utrzymywanie płynności błony. Oddziałują one z polarnymi głowami lipidów błonowych, nie dopuszczając do fizycznych zmian właściwości błony [4]. Powszechnie występujące substancje krioprotekcyjne to alkohole (glicerol) i węglowodany (glukoza). Glicerol jest syntetyzowany, zarówno u zwierząt tolerujących, jak i opornych na zamarzanie. Tworząc wiązania wodorowe z polarnymi cząsteczkami wody, utrudnia ich łączenie się w sieć krystaliczną, przez co obniża punkt krzepnięcia i rozszerza zakres przechłodzenia płynów ustrojowych. Dzięki zdolności przechodzenia przez błony komórkowe glicerol zapobiega zamarzaniu płynów w przestrzeniach zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych. Jego rola jest dobrze znana u wielu gatunków owadów, które oprócz glicerolu wykorzystują inne alkohole (sorbitol, rybitol, erytrytol, glikol) i disacharydy (trehaloza, sacharoza). Wśród płazów tylko rzekotka pstra (Hyla versicolor)⁵ i salamandra syberyjska (Hynobius keyserlingi)⁴ akumulują glicerol, natomiast pozostałe płazy, jako główną substancję krioprotekcyjną, wykorzystują glukozę. To właśnie z jej obecnością wiąże się obniżanie temperatury zamarzania u zmiennocieplnych kręgowców, nie tylko płazów, ale i gadów. Glukoza wydłuża czas przeżycia w stanie zamrożenia. Jest także źródłem energii w warunkach beztlenowych. Zarówno glicerol, jak i glukoza powstają z rozpadu glikogenu wątrobowego, dlatego zmiennocieplne kręgowce gromadzą olbrzymie rezerwy glikogenu w ostatnich dniach lata i wczesną jesienią, a więc na długo przed nastaniem zimy. U żółwi glikogen pełni funkcję substancji krioprotekcyjnej, gdyż zatrzymuje wodę wokół swych ziaren, uniemożliwiając jej wychodzenie do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Ogranicza to ilość wody, która może przybrać formę lodu.

Białka INP powodują powolne tworzenie się lodu na zewnątrz komórki, co chroni ją przed szokiem osmotycznym i eliminuje ryzyko powstawania lodu w jej wnętrzu. Natomiast białka THP zapobiegają wtórnemu powstawaniu kryształów lodu w czasie topnienia i ponownego zamarzania. Ich rola jest dobrze znana u ryb i morskich bezkręgowców oraz wielu gatunków owadów.

Niezależnie od tego, czy zwierzęta kumulują substancje krioprotekcyjne na długo przed nastaniem chłodu (owady, jaszczurki), czy też uwalniają glukozę dopiero w odpowiedzi na zapoczątkowanie powstawania lodu (płazy), zawsze proces zamarzania jest regulowany. Powolne zamarzanie rozpoczyna się w częściach peryferycznych i rozszerza się w sposób kierunkowy na całe ciało. Lód formuje się najpierw w przestrzeniach na zewnątrz organów w jamie brzusznej. Wolne tempo tworzenia się lodu jest kluczem do przeżycia większości zwierząt tolerujących zamarzanie. Ma to istotne znaczenie, ponieważ uszkodzenia na poziomie komórkowym powstające w wyniku szybkiego ochładzania nie są niwelowane przez wysokie stężenia substancji krioprotekcyjnych. Topnienie rozpoczyna się jednocześnie w całym ciele, przy czym organy topnieją szybciej niż przestrzenie zewnątrzkomórkowe, w których jest lód.

Wszystkie zwierzęta, zarówno kręgowe, jak i bezkręgowe wykazują sezonową zmienność tolerancji zamarzania i oporności na zamarzanie. Zatem słuszne wydaje się stwierdzenie, że nawet zwierzęta zmiennocieplne, których życie jest warunkowane temperaturą otoczenia, nie są zaskakiwane przez chłód, a proces kumulacji związków krioprotekcyjnych reguluje u nich zegar biologiczny.